Concept of natural genome reconstruction. Part 4. Integration of extracellular double-stranded DNA fragments into the genome of hematopoietic stem cells and the formation of extrachromosomal intermediates.

内容摘要

To assess the possibility of integrating extracellular double-stranded DNA fragments into the recipient genome of hematopoietic stem cells, a complex substrate was constructed consisting of the entire M13F-AluI-M13R fragment and its two restrictive derivatives, appearing after hydrolysis with restriction endonucleases EcoRI and HindIII: M13F-AluI-EcoRI and M13R-AluI-HindIII. The substrate contained a pBlueScript+ plasmid polylinker sequence, absent in the human genome, which framed the human AluI fragment cloned at the EcoRV site. Human bone marrow cells were treated with the DNA of the constructed complex substrate; taking into account the repair time of pangenomic single-strand breaks, preparations of metaphase plates were obtained. FISH revealed specific fluorescent signals. Simultaneously, DNA isolated from colonies obtained from bone marrow cells treated with a complex substrate was sequenced. Two rounds of sequencing were carried out: whole-genome and selective after targeted hybridization on metal beads. The results obtained indicate that homologous exchange between extrachromosomal and chromosomal DNA is possible. Integration into the genome via the single-strand annealing mechanism, involving microhomologies, is also possible. Intermediates were discovered that suggest the existence of an unusual integration into the genome at the nick of one end of the fragment and the other end of the fragment hanging freely into the interchromosomal space. A direct assessment of the possibility of integrating TAMRA-labeled fragments of fragmented human DNA and E. coli DNA into the genome of recipient cells was carried out using a human bone marrow cell model. The results obtained indicate that specific signals of homologous DNA are distributed throughout the chromosome body (human bone marrow cell model). Signals from nonhomologous E. coli DNA are predominantly concentrated in the centromeric regions of chromosomes. The ratio of the number of obtained reads with integration elements and FISH signals suggested the existence of a strong interaction between extracellular fragments and chromosomal DNA. Experiments have been conducted showing that linear plasmid DNA, after internalization into hematopoietic stem cells, forms a monomer ring. Internalized into the intracellular space, extracellular plasmid DNA is isolated together with chromosomal DNA after stringent purification and fractionation procedures. This fact suggests the existence of a strong ring associate of plasmid DNA and chromosome DNA formed without the participation of a protein framework in the form of a looped chromosomal strand. Для оценки возможности интеграции в реципиентный геном гемопоэтических стволовых клеток экстраклеточных фрагментов двуцепочечной ДНК был сконструирован сложно составленный субстрат, состоящий из целого М13F-AluI-M13R фрагмента и двух его производных, появляющихся после гидролиза рестриктазами EcoRI и HindIII: M13F-AluI-EcoRI и М13R-AluI-HindIII. В субстрате была представлена последовательность полилинкера плазмиды pBlueScript+, отсутствующая в геноме человека, которая обрамляла клонированный по сайту EcoRV AluI фрагмент человека. Клетки костного мозга человека были обработаны ДНК сконструированного сложно составленного субстрата, и с учетом времени репарации пангеномных одноцепочечных разрывов из клеток выросших колоний получены препараты метафазных пластинок. Проведенная FISH выявила специфические сигналы свечения. Одновременно ДНК, выделенная из колоний, полученных из клеток костного мозга, обработанных сложно составленным субстратом, была секвенирована. Проведено два раунда секвенирования: полногеномное и селективное после таргетной гибридизации на металлических бусах. Полученные результаты свидетельствуют, что гомологичный обмен между экстрахромосомальной и хромосомной ДНК возможен. Также возможна интеграция в геном по механизму однонитевого отжига, с участием микрогомологий. Обнаружены интермедиаты с одним концом фрагмента, интегрированным в геном по участку микрогомологии, и другим концом фрагмента, свободно свисающим в межхромосомное пространство. Проведена прямая оценка возможности интеграции TAMRA-меченых фрагментов двуцепочечной ДНК человека и E. coli в реципиентный геном на модели клеток костного мозга человека. Обнаружено, что специфические сигналы гомологичной ДНК распределены по телу хромосом (модель клеток костного мозга человека). Сигналы негомологичной ДНК E. coli преимущественно сконцентрированы в центромерных районах хромосом. Соотношение количества полученных ридов с элементами интеграции и сигналов FISH предполагало существование прочного взаимодействия экстраклеточных фрагментов и ДНК хромосом. В экспериментах показано, что линейная плазмидная ДНК после интернализации в гемопоэтические стволовые клетки формирует кольцо мономера. Интернализованная во внутриклеточное пространство экстраклеточная плазмидная ДНК выделяется совместно с ДНК хромосом после жестких процедур очистки и фракционирования. Этот факт предполагает существование прочного кольцевого ассоциата ДНК плазмиды и ДНК хромосом, сформированного без участия белкового каркаса в форме закольцованной хромосомной нити.